1877 0

Структура молекул главного комплекса гистосовместимости I класса

На рис. 9.3, А показана общая схема молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса человека или мыши. Каждый ген МНС I класса кодирует трансмембранный гликопротеин, молекулярной массой около 43 кДа, который обозначается как α или тяжелая цепь. Он включает три внеклеточных домена: α1, α2 и α3. Каждая молекула МНС I класса экспрессируется на клеточной поверхности в нековалентной связи с инвариантным полипептидом , называемым β2-микроглобулином (β2-m молекулярная масса 12 кДа), который кодируется на другой хромосоме.

Рис. 9.3. Разные изображения молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса

Он имеет структуру, гомологичную единичному домену Ig, и в самом деле является представителем этого суперсемейства. Таким образом, на клеточной поверхности структура МНС I класса плюс β2m имеет вид четырехдоменнои молекулы, в которой к мембране примыкают домен α3 молекулы МНС I класса и β2m.

Последовательности различных аллельных форм молекул главного комплекса гистосовместимости I класса очень схожи. Различия аминокислотных последовательностей среди молекул МНС сосредоточены на ограниченном участке их внеклеточных доменов α1 и α2. Таким образом, индивидуальная молекула МНС I класса может быть разделена на неполиморфную, или инвариантную, область (одинаковую для всех аллельных форм 1 класса) и полиморфную, или вариабельную, область (уникальную последовательность для данного аллеля). Т-клеточные молекулы CD8 связываются с инвариантными областями всех молекул главного комплекса гистосовместимости I класса.

Все молекулы МНС I класса, подвергнутые рентгеновской кристаллографии, имеют одинаковую общую структуру, изображенную на рис. 9.3, Б и В. Наиболее интересной особенностью строения молекулы является то, что максимально удаленная от мембраны часть молекулы, состоящая из доменов α1 и α2, имеет глубокую бороздку или полость. Эта полость в молекуле МНС I класса является местом связывания пептидов. Полость напоминает корзину с неровным дном (сплетенную из аминокислотных остатков в виде плоской β-складчатой структуры), а окружающие стенки представлены α-спиралями. Полость закрыта с обоих концов, поэтому в нее вмещается цепочка, состоящая из восьми или девяти аминокислотных последовательностей.

Сравнивая последовательности и структуру полости у разных молекул главного комплекса гистосовместимости I класса, можно обнаружить, что дно каждой из них различно и состоит из нескольких карманов, специфичных для каждого аллеля (рис. 9.3, Г). Форма и заряд этих карманов на дне полости помогают определить, какие пептиды связываются с каждой аллельной формой молекулы МНС. Карманы также помогают закрепить пептиды в таком положении, в котором они могут распознаваться специфичными TCR. На рис. 9.3, Г и 8.2 показано взаимодействие пептида, размещенного в полости, и участков молекулы МНС I класса с Т-клеточным рецептором.

Центр связанного пептида - единственная часть белка, не спрятанная внутри молекулы главного комплекса гистосовместимости, - взаимодействует с CDR3-TCR α и β, которые являются наиболее вариабельными в Т-клеточном рецепторе. Это означает, что для распознавания пептида TCR необходим контакт с небольшим количеством аминокислот центра пептидной цепочки.

Отдельная молекула МНС I класса может связываться с разными пептидами, но преимущественно с теми, которые обладают определенными (специфичными) мотивами (последовательностями). Такими специфичными последовательностями являются инвариантно расположенные 8 - 9 аминокислотных остатков (якорные последовательности), обладающие высоким сродством к аминокислотным остаткам в пептидсвязывающей полости данной молекулы МНС. При этом аминокислотные последовательности в позициях, не являющихся якорными, могут быть представлены любым набором аминокислотных остатков.

Так, например, человеческая молекула I класса HLA-А2 связывается с пептидами, имеющими во второй позиции лейцин, а в девятой - валин; в отличие от нее другая молекула HLA-A связывает только белки, у которых в якорную последовательность входят фенилаланин или тирозин в позиции 5 и лейцин в позиции 8. Другие позиции в связываемых пептидах могут быть заполнены любыми аминокислотами.

Таким образом, каждая из молекул главного комплекса гистосовместимости может связываться с большим количеством пептидов, обладающих различными аминокислотными последовательностями. Это помогает объяснить, почему ответы, опосредованные Т-клетками, могут развиться, за редким исключением, по меньшей мере к одному эпитопу почти всех белков и почему случаи отсутствия иммунного ответа на белковый антиген очень редки.

Структура молекул главного комплекса гистосовместимости II класса

Гены α и β МНС II класса кодируют цепи массой около 35000 и 28000 Да соответственно. На рис. 9.4, А показано, что молекулы МНС II класса, как и I класса, являются трансмембранными гликопротеинами с цитоплазматическими «хвостами» и внеклеточными доменами, похожими на Ig; домены обозначают α1, α2, β1, и β2.

Молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса также являются членами суперсемейства иммуноглобулинов. Как и у молекул МНС I класса, в состав молекулы МНС II класса входят вариабельные, или полиморфные (различные у разных аллелей), и инвариабельные, или неполиморфные (общие для всех аллелей), области. T-клеточная молекула CD4 прикрепляется к неизменяемой части всех молекул главного комплекса гистосовместимости II класса.

Рис. 9.4. Разные изображения молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса

На вершине молекулы МНС II класса также есть выемка или полость, способная связываться с пептидами (рис. 9.4, Б и В), которая структурно аналогична полости молекулы МНС I класса. Однако в молекуле главного комплекса гистосовместимости II класса полость формируется путем взаимодействия доменов разных цепочек, а и р. На рис. 9.4, В показано, что дно полости молекулы МНС II класса состоит из восьми β-складок, причем домены α1 и β1 образуют по четыре из них каждый; спиральные фрагменты доменов α1 и β1 формируют каждый по одной стенке полости.

В отличие от полости молекулы МНС I класса полость молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса открыта с обеих сторон, что позволяет связывать более крупные белковые молекулы. Таким образом, полость молекулы МНС II класса может связывать пептиды, длина которых варьирует от 12 до 20 аминокислот в линейной цепочке, при этом концы пептида оказываются за пределами полости. На рис. 9.4, Г показано, что TCR взаимодействует не только с пептидом, связанным с молекулой МНС II класса, но и с фрагментами самой молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса.

Пептиды, которые связываются с различными молекулами МНС II класса, также должны обладать определенными мотивами (последовательностями); поскольку длина пептидов в этом случае более вариабельна, чем у пептидов, которые могут прикрепляться к молекуле МНС I класса, мотивы чаше располагаются в центральной области пептида, т.е. в том месте, которое соответствует внутренней поверхности полости молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса.

Р.Койко, Д.Саншайн, Э.Бенджамини

МНС человека имеет акроним HLA (от англ. Human Leukocyte Antigens – антигены лейкоцитов человека). Это связано с тем, что они были впервые обнаружены на лейкоцитах человека в реакциях с сыворотками от многорожавших женщин и больных, получавших многократные гемотрансфузии. Такие сыворотки содержат антилейкоцитарные антитела, которые образуются в ответ на аллоантигены плода или доноров крови.

Комплекс HLA локализован на хромосоме 6, занимая область размером 3-4 6 пар нуклеотидов. Представления о масштабах HLA-генофонда заметно расширились с внедрением моноклональных анти-HLA антител и молекулярно-генетического анализа, т.е. прямого изучения HLA-генов. Согласно имеющимся данным комплекс HLA включает около 800 аллелей, альтернативное наследование которых обеспечивает беспрецедентную мозаику HLA-генотипов. В соответствии с генетической структурой HLA каждый индивид наследует около 20 аллельных генов (см. ниже). Благодаря столь малой выборке (20 из 800) вероятность полного совпадения индивидуальных HLA-генотипов (и, следовательно, HLA-фенотипов) ничтожно мала. Совпадение возможно лишь по отдельным аллелям или их комбинациям. Этим определяется вероятность относительно успешного приживления тканей в аллогенных парах «донор-реципиент».

Лишь малая часть МНС(HLA)-области кодирует антигены гистосовместимости. Кроме них здесь локализовано более 100 генов, которые не имеют отношения к тканевому полиморфизму и иммунологическим функциям молекул МНС. Тем не менее этот участок ДНК продолжают называть главным комплексом гистосовместимости, подчеркивая исторический приоритет и значимость MHC-зависимых реакций.

Дополнительное разнообразие вносит диплоидность соматических клеток, благодаря которой каждая из них содержит по два комплекта МНС-генов, на материнской и отцовской хромосомах. Это означает, что индивид может иметь не более двух аллелей каждого HLA-гена (по одному на материнской и отцовской хромосомах) и, следовательно, не более двух разновидностей каждого HLA-антигена.

Набор генов одной хромосомы, называется гаплотипом (от греч. haplous – единственный). МНС-гаплотипы кодоминантны, т.е. одинаково влияют на фенотип клеток. Это означает, что HLA-фенотип (т.е. полный комплект молекул HLA, экспрессируемых клетками данного организма) является суммарным выражением двух гаплотипов, унаследованных по материнской и отцовской линиям.

МНС(HLA)-фенотип можно определить как уникальную совокупность поверхностных антигенов, по которой клетки одного индивида отличаются от всех остальных особей данного вида животных. Следует понимать принципиальное различие между полиморфизмом молекул МНС и антигенных рецепторов В и Т лимфоцитов (BCR и TCR). В первом случае речь идет об аллотипии, связанной с альтернативным наследованием аллельных генов, циркулирующих в популяциях человека и животных; во втором – об идиотипии, т.е. о структурных вариантах одних и тех молекул, продуцируемых разными клонами клеток. Иными словами, идиотипия отражает гетерогенность молекул на уровне клеточных популяций, возникающую в результате мутаций и рекомбинационных перестроек генетического материала соматических клеток. Аллотипия определяется перетасовкой (рекомбинацией) генов в зародышевых клетках. Она связана с половым процессом и формируется на уровне «организменных» популяций.

Для всех видов животных характерно наличие двух основных классов МНС – МНС-I и МНС-II. При общей стратегии они различаются по генетической, структурной организации, тканевому распределению и функциям.

HLA-I. Молекулы I класса содержатся на поверхности клеток всех типов, кроме эритроцитов и ворсинчатого трофобласта. Они представляют гетеродимеры, состоящие из двух полипептидных цепей - тяжелой (46 кД) и легкой (12 кД) (рис. 1). Из них только тяжелая субъединица (α-цепь) является продуктом главного комплекса гистосовместимости, и именно с ней связаны иммунологические функции молекулы. α-цепь пронизывает плазматическую мембрану и имеет три внеклеточных домена – α1, α2 и α3. Вариабельность молекулы сконцентрирована в α1 и α2 доменах; домен α3 лишен полиморфизма.

Легкая (β) цепь представлена β2-микроглобулином. Это продукт гена, который локализован на хромосоме 15, т.е. не входит в состав комплекса HLA. β2-микроглобулин генетически однороден и напрямую не участвует в реализации функций HLA-I. Его роль сводится к транспорту α-цепи на поверхность клетки (у мутантных мышей, лишенных β2-микроглобулина, молекулы I класса не экспрессируются). β2-микроглобулин не имеет трансмембранного участка, удерживаясь на мембране за счет нековалентной связи с α3-доменом1.

Рис. 1. Структура молекул главного комплекса гистосовместимости (G. Reeves, p. 46).

Молекулы HLA-I представлены тремя наиболее важными подклассами – А (HLA-A), В (HLA-B) и С (HLA-C). Они кодируются одноименными генами, которым соответствует определенная позиция (локус) на хромосоме. По данным молекулярно-генетического анализа общее число аллельных вариантов для генов HLA-1 приближается к 400 (HLA-A – 108, HLA-B – 223, HLA-C – 67). Количество известных HLA-1 антигенов гораздо меньше – около 100 (HLA-A – 28, HLA-B – 61, HLA-C –10)1. Они обозначаются цифрами, которые добавляются к буквенному обозначению подкласса (например, А1, В27, С8).

В генотипе каждого человека имеется шесть генов HLA-I – по три в каждом гаплотипе. При несовпадении материнского и отцовского гаплотипов по генам всех трех локусов (А, В и С) индивид будет иметь наиболее полный HLA-фенотип, т.е. шесть аллотипических вариантов HLA-I (например, А4,14; В2,31; С4,10). Если гаплотипы частично дублируют друг друга, набор молекул HLA-I будет редуцирован (например, А4; В2,44; С6). То же самое справедливо для HLA-II (см. ниже).

Недавно открыты дополнительные локусы HLA-I: E, F и G. Их гены отличаются ограниченным полиморфизмом и необычным тканевым распределением своих продуктов (HLA-E, HLA-F и HLA-G). Функции этих так называемых «неклассических» HLA(МНС)-молекул неизвестны, но они не участвуют в представлении антигенов, по крайней мере «обычных пептидов» (см. ниже).

HLA-II. Молекулы II класса построены из двух нековалентно связанных пептидных цепей примерно одинакового размера – α (35 кД) и β (28 кД). Обе они являются продуктами главного комплекса гистосовместимости и участвуют в реализации его иммунологических функций. Каждая цепь состоит из двух внеклеточных доменов (α1-α2 и β1-β2), которые прочно фиксированы на клетках при помощи трансмембранного участка молекулы (рис. 8). Вариабельные последовательности входят в состав α1 и β1 доменов; α2 и β2 домены не имеют аллотипов.

В отличие от HLA-I, конститутивная (т.е. постоянная) экпрессия молекул II класса ограничена клетками иммунной системы, презентирующими антигены Т-хелперам. Это так называемые профессиональные антигенпредставляющие клетки – дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты. Появление HLA-II на других клетках указывает на их активацию, т.е. является индуцибельным.

Впрочем, динамичность экспрессии молекул МНС (MHC-I, MHC-II) характерна для всех клеток. Она зависит от функционального состояния клетки, меняясь под влиянием различных стимулов (например, цитокинов). Это однин из механизмов, контролирующих индукцию и реализацию иммуного ответа.

Подобно HLA-I, молекулы HLA-II представлены тремя основными подклассами – DR, DQ и DP. Гены, кодирующие их α- и β-цепи, сконцентрированы в одноименных локусах на 6-й хромосоме. Наиболее полиморфны гены β-цепей: они представлены 367 аллельными вариантами (DR – 249, DQ – 36, DP – 82). Гены α-цепей гораздо однороднее – 36 разновидностей (DR – 3, DQ – 20, DP – 13).

Буква "D" ошибочно продолжает нотацию HLA, начатую локусами А, В и С. Эти обозначения возникли до разделения HLA на классы. Область D оказалась суммой нескольких локусов (DR, DQ, DP) и по сути является синонимом II класса. «Неклассические» молекулы HLA-II включают HLA-DM и HLA-DN. Их функции неизвестны или гипотетичны.

В генотипе каждого человека имеется 12 функционально значимых (т.е. экспрессируемых) генов HLA-II – шесть в каждом гаплотипе (по три гена для α (DRA, DQA, DPA) и β (DRB, DQB, DPB) цепей). В связи с доминированием полиморфизма В(β)-генов в цифровой формуле молекул II класса обычно указываются разновидности только β-цепей (например, R4,8/DQ1,6/DP5).

Функции МНС (HLA)

Отторжение чужеродных тканей, которое происходит в ситуациях, искусственно создаваемых человеком, ничего не говорит о физиологических функциях МНС. С этой точки зрения неудачна и терминология: понятие «главный комплекс гистосовместимости» не отражает природного назначения его продуктов. Это стало очевидным после утверждения центральной позиции МНС в представлении (презентации) антигенов Т-лимфоцитам. Возможно, это не единственное, но, безусловно, главное назначение данной системы.

МНС-зависимое представление антигенов имеет четкую направленность, которая проявляется в том, что молекулы I и II классов обеспечивают альтерантивную презентацию антигенов двум основным категориям Т-клеток – CD8 и CD4. Такая адресность объясняется лиганд-рецепторной комплементарностью в парах CD8 – МHC-I и CD4 – МНС-II. Это обеспечивает избирательное связывание CD8 с МНС-I (a3-домен), а CD4 – с МНС-II (b2-домен). Этим объясняется корецепторная функция молекул CD4 и CD8 в распознавании антигенов Т-лимфоцитами (рис. 2).

Зависимость реакций Т-лимфоцитов от МНС называется рестрикцией (от англ. restriction – ограничение). Говорят, что Т-лимфоциты рестриктированы по МНС, причем CD4 Т-лимфоциты рестриктированы по МНС(HLA)-I, а CD8 – по МНС(HLA)-II.

Рис. 2. Молекулы, принимающие участие в распознавании антигенов Т-лимфоцитами. Т-лимфоциты рестриктированы по МНС, т.е. распознают антигены (точнее продукты их протеолиза), презентируемые молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) антигенпредставляющих клеток. А: Антигенные пептиды в комплексе с молекулами МНС-I воспринимаются CD8 Т-клетками. CD8 играет роль корецептора, реагируя с консервативным (неполиморфным) участком МНС-I. Взаимодействие в системе TCR-антиген/МНС-I-СD-8 генерирует сигнал, который усиливается и транслируется внутрь клетки при помощи CD3-комплекса. В: Антигенные пептиды, презентируемые молекулами МНС-II, воспринимаются CD4 Т-лимфоцитами. Благодаря комплементарности c МНС-II, СD4 выполняет функцию корецептора, укрепляя контакт между TCR и комплексом антиген/МНС-II. Сигнал транслируется в клетку молекулами костимулирующего CD3-комплекса (D.M. Weir, J. Stewart. Immunology. 8 th ed. Churchill & Levinstone. 1997).

Учитывая универсальность тканевого распространения молекул I класса, следует ожидать, что в представлении антигенов могут участвовать многие типы клеток. Именно так обстоит дело на этапе реализации иммунного ответа, когда любая клетка, презентирующая на своей поверхности “чужие” антигены в комплексе с МНС-I, атакуется цитотоксическими (СD8) Т-лимфоцитами. Активность молекул II класса связана главным образом с профессиональными антигенпредставляющими клетками. Они презентируют антигены Т-хелперам, опираясь на корецепторную активность CD4. Возможность индуцированной экспрессии МНС-II на эндотелиоцитах, эпителиальных и ряде других клеток допускает вероятность «непрофессиональной» MHC-II–презентации антигенов CD4 Т-лимфоцитам. Это возможно на этапе реализации иммунного ответа.

Для индукции иммунного ответа этого недостаточно. Здесь требуется более сложная кооперация антигенпредставляющих клеток и Т-лимфоцитов. Она происходит при участии нескольких пар комплементарных адгезивных молекул и цитокинов на территории лимфоидных тканей, т.е. в зоне, оптимальной для взаимодействия иммунокомпетентных клеток (см. «Индукция иммунного ответа»).

Презентация антигенов молекулами I и II классов происходит по общей схеме. Короткие пептиды (Т-эпитопы), которые образуются из белковых антигенов в результате внутриклеточного протеолиза (процессинг), соединяются с комплементарными молекулами МНС и вместе с ними выносятся на поверхность клетки*.

* Антигенные пептиды, воспринимаемые МНС-I и MHC-II, построены соответственно 9-10 и 12-25 аминокислот. Большинство из них являются внутренними фрагментами молекул, которые обнажаются после протеолиза. Пептидосвязывающий участок молекул МНС представляет собой щель, образуемую комбинацией вариабельных доменов: a1-a2 (MHC-I) и a1-b1 (MHC-II). Аллельные варианты МНС отличаются по конфигурации “пептидной ловушки” и, следовательно, по сродству к различным пептидам.

Принципиальное различие между МНС-I и MHC-II связано с источником (происхождением) представляемых антигенов. Молекулы I класса презентируют антигены, которые образуются внутри собственных клеток – “эндогенные пептиды”. К их числу относятся производные вирусных и опухолевых антигенов. Молекулы II класса воспринимают пептиды экзогенной природы. Они образуются из материала, поступающего в клетки извне, путем эндоцитоза.

Это различие не абсолютно. При гибели клеток синтезированные ими (т.е. эндогенные) антигены могут поглощаться дендроцитами и макрофагами и экспрессироваться в комплексе с MHC-II, как это характерно для экзогенных пептидов. Возможен и альтернативный механизм: переключение потока антигенных пептидов с экзогенного пути (комплексирование с MHC-II) на эндогенный (комплексирование с MHC-I). Такого рода перекрестная презентация содействует развитию полноценных Т-клеточных реакций, нацеленных, в частности, против вирусов, которые не реплицируются в профессиональных антигенпредставляющих клетках.

Повторим, что ассортимент каждого индивида ограничен примерно 20 вариантами аллельных генов и соответственно молекул MHC(HLA). Это несопоставимо с изобилием антигенных пептидов, которые потенциально могут быть представлены Т-лимфоцитам. Отюда следует, что каждая молекула МНС способна презентировать не один, а множество пептидов1. В то же время все пептиды, воспринимаемые однотипным вариантом МНС, имеют элементы структурного сходства, которые обеспечивают фиксацию в “пептидной ловушке” МНС. Это не лишает их антигенной (эпитопной) индивидуальности, так как специфичность Т-эпитопов определяется всего 1-2 аминокислотами.

Вероятность и прочность связывания разных пептидов с одной и той же молекулой МНС неодинакова, отражая степень родства (комплементарности) между пептидом и МНС. Справедливо и обратное: благодаря особенностям конфигурации пептидосвязывающего участка аллельные варианты МНС различаются по набору презентируемых ими пептидов. Здесь сконцентрирована идея о генетическом контроле иммунного ответа в системе МНС. Она сводится к тому, что индивиды с разными МНС(HLA)-фенотипами могут неодинаково (даже альтернативно) реагировать на один и тот же антиген. Это объясняется качеством взаимодействия антигенных пептидов с аллельными вариантами молекул МНС – от выраженной до нулевой аффинности. С этой точки зрения, концепция о генах, контролирующих силу иммунного ответа (Ir-гены, от англ. Immune response), во многом сливается с представлениями о главном комплексе гистосовместимости, прежде всего МНС-II. Это понятно, так как молекулы II класса презентируют антигены Т-хелперам, от активации которых зависят все формы иммунного ответа.

Презентация антигенов – сложный процесс, связанный с участием многих молекул. Для ряда из них возможны аллельные варианты, которые неодинаково влияют на функции МНС и поэтому тоже включаются в генетический контроль за иммунным ответом.

Влияние МНС на реактивность к антигенам наиболее отчетливо проявляется в опытах на линейных (инбредных) животных. Но положительные связи между МНС(HLA)-фенотипом и особенностями иммуного ответа известны и для человека. Так, носители аллелей HLA-DR2 и HLA-DR5 характеризуются склонностью к образованию IgE антител против аллергена пыльцы амброзии. Протективные пептиды вируса гриппа А встраиваются в молекулы В27 и А2; поэтому носители данных аллелей более устойчивы к гриппозной инфекции.

Загадкой остается предрасположенность к ряду болезней у лиц с определенным HLA-фенотипом, т.е. у носителей определенных HLA-I/HLA-II аллелей или их комбинаций. На этот счет имеется несколько гипотез, одна из которых базируется на неодинаковой способности аллотипических вариантов HLA связывать (презентировать) разные пептиды. Яркий пример – анкилозирующий спондилит (болезнь Бехтерева): около 90% больных являются носителями гена В27. Допускают, что молекулы этого аллотипа могут быть рецептором неизвестного вируса или избирательно представлять патогенетически значимые пептиды CD8 T-лимфоцитам.

Интригует и вопрос о причинах, приведших к формированию столь полиморфной системы генов и их продуктов. Согласно наиболее популярной версии главный комплекс гистосовместимости эволюционировал как механизм, обеспечивающий распознавание достаточно большого количества антигенов для оптимальной защиты каждого вида животных от инфекционных агентов. Бесконечное многообразие МНС-генотипов гарантирует полноценность антигенраспознающего потенциала иммунной системы на уровне популяции. В то же время каждый из ее отдельных представителей, обладая малой выборкой из общего числа аллельных МНС-генов, ограничен более узким набором антигенпрезентирующих молекул. Иными словами, индивидуализация МНС влияет на спектр воспринимаемых антигенов и, следовательно, на качество иммунитета против экзогенной агрессии. Неадекватные аллели и их комбинации выбраковываются естественным отбором.

Не исключено, что специфика МНС оказывает влияние и на другие проявления биологической индивидуальности. Непонятной (но, вряд ли, случайной) является экспрессия на поверхности клеток аутологичных (собственных) пептидов в комплексе с МНС-I. Более того, на долю чужих антигенов приходится ничтожная часть пептидов, встраиваемых в молекулы I класса. Возможно, за этим скрыт механизм, поддерживающий иммунологическую толерантность к собственным тканям, но смысл может быть и другим. Замечено, например, что МНС-генотип влияет на сексуальное поведение животных. При спаривании мыши отдают предпочтение партнерам гетерологичных линий, т.е. особям с другим МНС-генотипом. Поразительно, но речь скорее всего идет о способности дифференцировать структурные особенности МНС по запаху, т.е. продукты МНС-аллельных генов играют роль феромонов. В этом есть логика. Она нацелена на повышение генетического полиморфизма популяции.

Естественно, для человека это невозможно. Но утеряв функцию выбора сексуального партнера, HLA-система «пытается» защитить его от появления HLA-гомозигот. Было проведено сопоставление совместимых по антигенам HLA классов I и II супругов в группе с нормально протекающей беременностью и в группе с беременностью, неоднократно прерывавшейся спонтанным абортом. Оказалось, что в группе с физиологически протекающей беременностью более чем в половине случаев муж и жена были полностью несовместимы по HLA-II. Количество HLA-совместимых пар по антигенам класса I составило около 2%. Напротив, в группе женщин с привычной невынашиваемостью только 26% супружеских пар оказались несовеместимыми по антигенам HLA-I; совместимость по антигенам класса II наблюдалась более чем в половине случаев (цит. Р.М.Хаитов, Л.П.Алексеев. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека. Иммунология, 2001, № 3, С. 4-12).

1От англ. B С ell R eceptor.

2 Мембраносвязанная и секреторная формы иммуноглобулинов образуются благодаря альтернативному сплайсингу первичного ДНК-транскрипта (мРНК). Секреторная форма лишена трансмембранного фрагмента, необходимого для закрепления молекулы на клеточной мембране.

3 На определенных этапах «доантигенной» дифференцировки В-лимфоциты содержат mIgD. Его участие в индукции иммунного ответа остается неясным. В отличие от IgM, лишь ничтожная часть IgD cекретируется в среду.

4 mIg вместе с CD79a и CD79b образует рецепторный комплекс В-лимфоцитов (BCR-комплекс).

1От англ. T С ell R eceptor.

1 Вместе с TCR компоненты CD3 образуют рецепторный комплекс Т-лимфоцитов (TCR-

комплекс). Цепи TCR экспрессируются на клеточной мембране только в сочетании с CD3.

1 Средняя вероятность полной MHC(HLA)-идентичности двух произвольно взятых людей приближается к 1 на 1 000 000 (цит. Р.М.Хаитов, Л.П.Алексеев. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека. Иммунология, 2001, № 3, С. 4-12).

1β2-микроглобулин легко сбрасывается с клетки, и его определение в крови и моче использует

ся в диагностике некоторых (прежде всего гематологических) заболеваний.

1Цит. Р.М. Хаитов и соавт. Достижения иммуногенетики – медицине. Иммунология, 1999, № 1, с. 10-17

1 Речь идет не об одновременной презентации, а о потенциальной способности связывать разные

антигенные пептиды.

ГОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России Кафедра клинической иммунологии с аллергологией

ГЛАВНЫЙ КОМПЛЕКС ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

Учебно-методическое пособие по общей иммунологии. Тверь 2008.

Продукты

Учебно-методическая разработка для практических занятий по общей иммунологии для студентов 5 курса лечебного и педиатрического факультетов, а также для клинических ординаторов и врачей, интересующихся вопросами иммунологии.

Составлена доцентом Ю.И.Будчановым.

Заведующий кафедрой, профессор А.А.Михайленко Методическая рекомендация утверждена на цикловой методической комиссии ТГМА п

© Будчанов Ю.И. 2008 гг.

Мотивация Иммуногенетика – новый, важный раздел иммунологии. Знание системы гистосовместимости

необходимо не только в трансплантологии, но и в понимании регуляции иммунного ответа, так и взаимодействия клеток при иммунном ответе. Определение HLA-антигенов используется в судебной медицине, популяционно-генетических исследованиях и в изучении гене предрасположенности к заболеваниям.

1. Студент должен знать: А. Строение HLA-системы человека.

Б. HLA антигены I, II классов и их роль в межклеточных взаимодействиях. В. Понятия генотипа, фенотипа, гаплотипа.

Г. Значение HLAтипирования в медицине.

Д. Взаимосвязь HLA-антигенов и ряда заболеваний человека. 2. Студент должен уметь:

Применить полученные знания по иммуногенетике в клинической практике.

Вопросы для самоподготовки по теме занятия:

1. Понятие о генах и антигенах гистосовместимости. HLA система человека. Номенклатура, генная организация (гены классов I, II,III).

2. Антигены классов I и III, их роль в межклеточных взаимодействиях, в представлении антигена Т-лимфоцитам, в феномене двойного распознавания.

3. Понятие HLA фенотипа, генотипа, гаплотипа. Особенности наследования.

4. Методы исследования и типированияHLA системы: серологические, клеточноопосредованные, генные (полимеразная цепная реакция, зонды ДНК).

5. Практические аспекты типированияHLA антигенов. HLA в популяциях, биологическое значение.

6. HLA и заболевания человека, механизмы ассоциации.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология. Учебник. – 3-е

изд., М., Медицина, 2010. – 752 с. – [ с.241 - 263 ].

2. Хаитов Р.М. Иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2006. – 320с. – [с. 95 – 102].

3. Белозеров Е.С. Клиническая иммунология и аллергология. А-Ата., 1992, с. 31-34.

4. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. М., 1983.

5. Методическая разработка. 6. Лекция.

Дополнительная литература

Коненков В.И. Медицинская и экологическая иммуногенетика. Новосибирск, 1999 г. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М., 1999, с. 213-226.

Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. HLA и медицина. Сб. Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. М., 2001, с. 240-260.

СМОЖЕТЕ ЛИ ВЫ ОТВЕТИТЬ?

(Впишите дома . Самоконтроль позволит выявить трудные вопросы для обсуждения. На занятии Вы проверите правильность ответов, дополните их. Постарайтесь самостоятельно найти ответы и покажите, что Вам это по силам.)

1. В какой паре хромосом локализуется главный комплекс гистосовместимости у человека? …………… .

2. На клетках каких органов и тканей содержатся трансплантационные? …………антигены

……………………………………………………………………………….……………………. .

3. Что обозначает сокращениеHLA? ………………………………………………………………………….

………………………………………………………………………………………… .

4. На каких клетках не обнаруживаются антигены системыHLA? ……………………….…

…………………………………………………………………………………………. .

5. Из каких локусов, сублокусов состоит ГКГС: I класс ……..……… II класс ………………………………

III класс …………………………………….. .

6. Продукты генов какого класса ГКГС не экспрессируются на мембране клеток? ……………………… .

7. Какие клетки необходимо выделить для выявления HLA II класса? ………………..…………………… .

8. Какими методами выявляютHLA антигены? ……………………………………………………………

………………………………………………………………………………………….. .

9. У типируемого пациента выявлено6 возможных антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-C. Как называется такая ситуация? …………………………… .

10. Какой антиген гистосовместимости часто встречается у больных с анкилозирующим спондилитом?

…………………….. .

11. Какие гены входят HLAв класса III? ………………………………..……………………………

…………………………………………………………………………………………… .

12. Из каких цепей состоят антигены HLA класса I? ………………….

13. Из каких цепей состоят антигены HLA класса II? …………………

14. Цитотоксический лимфоцит (CD8) распознает чужеродный пептид в комплексе сHLA какого класса?

…………………………. .

15. Th (CD4+) распознает чужеродный антиген презентированный дендритной клеткой или макрофагом в комплексе с HLA какого класса? …..………

Каковы возможные комбинации эритроцитарных антигенов у ребенка, если изоантигенный состав

эритроцитов
Отца: AO, NM, ss, dd, Cc, Ee ,		а матери: AB, MM, SS, DD, Cc, EE .
Выберите правильный ответ.
	AO, MN, Ss, DD, CC, EE
	AA, MM, Ss, Dd, cc, ee
	OO, NN, Ss, Dd, CC, Ee
	AB, MN, Ss, Dd, cc, EE
	AO, NN, Ss, Dd, Cc, EE
	AB, MM, SS, Dd, cc, Ee
Напишите еще один правильный вариант ответа___, ___, ___, ___, ___, ___.			А больше можете?
Сколько? …………. .

Справочные и теоретические материалы

Главный комплекс гистосовместимости - ГКГС (англ. МНС – Major Histocompatibility Complex) представляет собой систему генов, контролирующих синтез антигенов, которые определяют гистосовместимость тканей при пересадках органов и индуцируют реакции, вызывающие отторжение трансплантатов. Поверхностные структуры цитомембраны клеток, индуцирующие реакции

отторжения, получили название антигенов гистосовместимости , а кодирующие их гены были названы генами гистосовместимости – Н-генами (Histocompatibility). Открытие антигенов гистосовместимости послужило основой развития трансплантационной иммунологии.

В последующем было доказано, что главный комплекс гистосовместимости является

основной генетической системой, определяющей функционирование иммунной системыи,

прежде всего Т-системы иммунитета. ГКГС регулирует иммунный отв ,еткодирует способност ь распознавать «своё» и «чужое», отторгать чужеродные клетки, способность синтезировать ряд

Совсем не обнаруживаются классические антигены системыHLA в жировой ткани и на эритроцитах, а так же на нейронах и клетках трофобласта.

		СХЕМА РАСПОЛОЖЕНИЯ ГЕНОВ СИСТЕМЫ HLA
		НА 6 ХРОМОСОМЕ
DP LMP TAP DQ DR		C2 Bf C4b C4a TNF

У человека главная система гистосовместимости получила названиеHLA-система (Human Leukocyte Antigens). Это система генов, контролирующих синтез антигенов гистосовместимости. Она состоит из трех регионов расположенных на коротком плече6-й хромосомы. Эти регионы носят название: класс 1, класс 2, класс 3 (класс I, класс II, класс III).В состав региона входят гены или локусы. В названии каждогоHLA-гена присутствует буквенное обозначение локуса(А, В, С) и порядковый номер, например: HLA-A3, HLA-B27, HLA-C2 и т.д. Одноименное обозначение имеют и антигены, кодируемые геном . В локусе D выявлено 3 сублокуса (DP, DQ, DR). (Смотри схему расположенную выше). В утвержденном ВОЗ списке насчитывается138 антигенов HLA. (Однако использование ДНК-типирования, т.е. возможности изучать сами гены, привело к выявлению буквально в последние годы более 2000 аллелей).

К I классу относятся HLA - А, -В и -С локусы. Эти три локуса главного комплекса гистосовместимости человека контролируют синтез трансплантационных антигенов, которые можно определить серологическими методами(CD – Serological Determined). Молекулы антигенов HLA I класса состоят из 2 субъединиц: α- и β- цепей (смотри рисунок). Тяжелая или α-цепь состоит из 3 внеклеточных фрагментов – доменов α1, α2, и α3 (экстрацеллюлярные домены), небольшого участка принадлежащего клеточной мембране(трансмембранный участок) и внутриклеточный фрагмент (цитоплазматический участок). Легкая цепь – β2 -микроглобулин, нековалентно связана с α-цепью, а с мембраной клетки не связана.

Домены α1 и α2 образуют углубление, в котором может располагаться пептид(участок антигена) длиной 8-10 аминокислот. Это углубление называют пептидсвязывающий клефт (от англ cleft).

(К новым антигенам HLA класса I открытым недавно относятся антигены MIC и HLA-G. О них мало что известно в настоящее время. Необходимо отметить HLA-G, который называют неклассическими, выявлен только

на поверхности клеток трофобласта и он обеспечивает иммунологическую толерантность матери к антигенам плода.)

Регион класса 2 (D-регион) системы HLA состоит из 3 сублокусов: DR, DQ, DP, кодирующих трансплантационные антигены. Эти антигены относят к разряду антигенов выявляемых клеточноопосредованными методами, а именно реакцией смешанной культуры лимфоцитов(англ. mixed lymphocyte culture – MLC). В последнее время выделены ещё локусы HLA-DM, -DN , а также гены ТАР и LMP (не экспрессированы на клетках). Классическими являются DP, DQ, DR .

Красным цветом показан презентируемый пептид

Недавно были получены антитела, с помощью которых удается идентифицировать антигены DR и DQ. Поэтому антигены второго класса в настоящее время определяются не только клеточноопосредованными методами, но и серологически, так же как и антигены HLA 1 класса.

Молекулы HLA 2-го класса представляют собой гетеродимерные гликопротеиды, состоящие из двух разных цепей α и β(смотри рисунок). Каждая цепь содержит по 2 внеклеточных домена α1 и β1 на N-терминальном конце, α2 и β2 (ближе к мембране клетки). Имеются ещё трансмембранный и цитоплазматический участки. α1 и β1домены формируют углубление, которое может связывать пептиды длиной до 30 аминокислотных остатков.

Белки МНС-II экспрессированы не на всех клетках. HLA молекулы II класса в большом количестве присутствуют на дендритных клетках, макрофагах и В-лимфоцитах, т.е. на тех клетках, которые взаимодействуют с Т-лимфоцитами-хелперами во время иммунной реакции, с помощью

HLA молекул II класса

Т-лимфоциты

значительного количества

антигенов2-го класса, но при стимуляции митогенами, ИЛ-2

начинают экспрессировать молекулы HLA 2-го класса.

Необходимо

отметить,

все 3 вида интерферонов

значительно усиливают

экспрессию

молекул HLA 1-го

на клеточной мембране различных клеток. Так

γ-интерферон в

значительной мере усиливает экспрессию молекул 1-го класса на Т- и В-лимфоцитах, но коме того на клетках злокачественных опухолей (нейробластом и меланом).

Иногда обнаруживается врожденное нарушение экспрессии молекулHLA 1-го или 2-го классов, что приводит к развитию«синдрома голых лимфоцито в». Больные с такими нарушениями страдают недостаточностью иммунитета и зачастую погибают в детском возрасте.

Регион III класса содержит гены, продукты которых непосредственно вовлечены в иммунную реакцию. Он включает структурные гены для компонентов комплемента С2 и С4, Bf (пропердиновый фактор) и гены фактора некроза опухолей– ФНО (TNF). Сюда входят гены, кодирующие синтез 21гидроксилазы. Таким образом, продукты HLA-генов 3 класса не экспрессированы на клеточной мембране , а они находятся в свободном состоянии.

HLA-антигенный состав тканей человека определяют аллельные, геныотносящиеся к каждому из локусов, т.е. на одной хромосоме может быть только по одному гену каждого локуса.

В соответствии с основными генетическими закономерностями каждый индивидуум является носителем не более двух аллелей каждого из локусо ви сублокусов (по одному на каждой из парных аутосомных хромосом). В гаплотипе (набор аллелей на одной хромосоме) присутствует по одному аллелю каждого из сублокусовHLA. При этом, если индивид гетерозиготе н по всем аллелямHLAкомплекса, у него при типировании(A, B, C, DR, DQ, DP – сублокусов) выявляется не более двенадцати HLA антигенов. Если индивид гомозиготен по некоторым антигенам, у него выявляется меньшее число антигенов, однако это число не может быть меньше 6.

Если у типируемого субъекта выявлено максимально возможное количество антигеновHLA, это получило название «full house» («полный дом» антигенов).

Наследование HLA-генов происходит по кодоминантному типу, при котором у потомства в

Наиболее богаты антигенамиHLA – лимфоциты. Поэтому выявление этих антигенов проводится именно на лимфоцитах. (Вспомните, как выделить из периферической крови лимфоциты).

Молекулы антигенов HLA-A, -B, -C составляют около 1% белков поверхности лимфоцитов, что примерно равно 7 тыс. молекул.

Одним из наиболее значимых достижений в иммунологии явилось обнаружение центральной роли, которую играет МНС млекопитающих и человека в регуляции иммунного ответа. В строго контролируемых экспериментах было показано, что один и тот же антиген вызывает иммунный ответ разной высоты у организмов с разным генотипом,инаоборот, один и тот же организм может быть реактивным в различной степени по отношению к разным антигенам. Гены контролирующие такой высокоспецифичный иммунный ответ, названы Ir-генами (Immune response genes). Они локализованы в области 2-класса системы HLA человека. Ir-генный контроль реализуется через -Т систему лимфоцитов.

Центральным			клеточного		взаимодействия			иммунном		отявляетсяете
взаимодействие			молекулами HLA,			экспрессированными					поверхности
антигенпредставляющих клеток,			представляющих			для распознавания		чужеродный			антигенный
пептид, и антиген-распознающим рецептором – TCR (T-cell receptor)							на поверхности Т-лимфоцита
хелпера. При		одновременно			распознаванием		чужеродного				происходит

распознавание собственных HLA антигенов.

Т-лимфоцит хелпер (CD4+) распознает чужеродный антиген лишь в комплексе поверхностными молекулами ГКГС 2 класса антигенпредставляющих клеток.

Цитотоксические лимфоциты (Т-эффекторы, CD8+) распознают антиген,

например вирусной природы, в комплексе с молекулой HLA I класса клетки мишени. Экзогенные антигены представляются молекулами HLA II класса,

эндогенные – молекулами I класса.

(Таким образом, процесс распознавания чужеродного огранич(е сриктирован) собственными HLA-антигенами. Это и есть концепция «двойного распознавания» или «распознавания измененного своего».)

Важная роль системыHLA состоит также в том, что она контролирует синтез факторов комплемента, вовлекаемых как в классический(С2 и С4), так и альтернативный (Bf) пути активации комлемента. Генетически обусловленный дефицит этих компонентов комплемента, может вызвать предрасположенность к инфекционным и аутоиммунным заболеваниям.

Практическое значение HLA-типирования. Высокий полиморфизм делает системуHLA великолепным маркером в популяционно-генетических исследованиях и изучении генетической предрасположенности к заболеваниям, но в то же время создает проблемы в подборе пар донор– реципиент при трансплантации органов и тканей.

Популяционные исследования, проведенные во многих странах мира, выявили характерные различия в распределении HLAантигенов в разных популяциях. Особенности распределения HLA-

антигенов используются в генетических исследованиях для изучения структуры, происхождения и эволюции различных популяций. Например, грузинская популяция, относящаяся к южным европеоидам, имеет сходные черты HLA-генетического профиля с греческой, болгарской, испанской популяциями, указывающими на общность их происхождения.

Типирование HLA-антигенов широко используется в судебно-медицинской практике для исключения или установления отцовства, родства.

Обратите внимание на связь некоторых заболеваний с наличием в генотипе того или иного HLA-антигена. Это связано с тем, что HLA широко используется для изучения генетических основ предрасположенности к заболеваниям . Если раньше не предполагалось, например, что заболевание рассеянным склерозом имеет наследственную основу, то в настоящее время благодаря изучению связи с системойHLA факт наследственной предрасположенности твердо установлен. Используя

	системойHLA, для некоторых заболеваний определен также и способ наследования.
Например,	анкилозирующий		спондилит		аутосомно-доминантный			наследования,
гемохроматоз и врожденная адреналовая гиперплазия– аутосомно-рецессивный. Благодаря очень
	ассоциации	анкилозирующего		спондилита		антигеномHLA-B27, HLA-типирование

используется в диагностике ранних и неясных случаев этого заболевания. Выявлены генетические маркеры инсулинзависимого сахарного диабета.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Определение HLA антигенов «у доноров»

Типирование тканевых антигенов производят при помощи набора сывороток, состоящего из 50 и более антилейкоцитарных сывороток (сыворотки многорожавших женщин, дающие от 10 до 80% положительных реакций с лейкоцитами плода, или сыворотки добровольцев, иммунизированных

человеческими	лейкоцитами, содержащими				определенные SD-антигены.				Сыворотки
многорожавших женщин, в результате естественной иммунизацииHLA-антигенами мужа во время
беременности, содержат в ряде случаев антитела к HLA в достаточно высоком титре.).
Серологически		антигены			гистосовместимости				определяют
лимфоцитотоксического		теста (англ.		lymphocytotoxicity test).						называют
микро лимфоцитотоксическим				использования			постановке			микрообъем
ингредиентов.

Принцип его основан на взаимодействииHLA-молекул на поверхности лимфоцитов обследуемого человека со специфическими анти-HLA-антителами и комплементом, что приводит к гибели клеток. Гибель клеток определяется при обычном световом микроскопировании после окрашивания витальными красителями.

Суспензии лимфоцитов смешивают с антисывороткой к определенному антигену(HLA-B8, HLA-B27 и т.д.), инкубируют 1 час при 25 С, добавляют комплемент и инкубирует вновь 2ч при 37 С, а затем добавляют трипановый синий или эозин. В случае присутствия в лимфоцитах антигена, соответствующего антителам, содержащимся в сыворотке, антитела в присутствии комплемента повреждают мембрану лейкоцитов, краска проникает в их цитоплазму и они окрашиваются в синий или же в красный цвет (если использовался эозин).

Какие клетки будут окрашены при HLA-типировании?

На основании результатов типирования устанавливают степень совместимости донора и реципиента и возможность трансплантации органа или ткани между ними. Донор и реципиент должны быть совместимы по эритроцитарным антигенам АВО иRh, по лейкоцитарным антигенам системы HLA. Однако на практике трудно бывает подобрать полностью совместимых донора и реципиента. Селекция сводится к подбору наиболее подходящего доно. Трансплантация возможна при

несовместимости по одному из антигеновHLA, но на фоне значительной иммуносупрессии. Подбор оптимального соотношения антигенов гистосовместимости между донором и реципиент значительно продлевает жизнь трансплантата.

На занятии будут продемонстрированы планшеты HLAдля типирования лейкоцитов. Вспомните, как получить чистую суспензию лимфоцитов из клеток периферической крови. Подумайте, как защитить содержимое лунок от высыхания в процессе постановки реакции? Как получаются сыворотки для HLA типирования?

В настоящее время могут использоваться для типирования комплемент фиксирующие моноклональные антитела (МАТ). Они используются как в микролимфоцитотоксическом тесте, так и в реакции иммунофлуоресценции. Учет реакции возможен как люминисцентной микроскопией, так и с помощью проточного цитофлуориметра.

		современный метод		определенияHLA-генов ДНК-типирование . Он
основан на различных вариантах полимеразной цепной реакции (ПЦР) и молекулярной гибридизации.
	этих методов		заключается в	накоплении необходимого		анализа значительног
количества			её полимеризации и в использовании, комплементарныхзондов
анализируемым участкам ДНК. Причем одним из преимуществ ДНК-типирования является то, что не
требуется наличия жизнеспособных лимфоцитов, а используется ДНК любых клеток. А ведь
ДНК может храниться годами и десятилетиями. Для реакции необходимы,						дорогостоящие

олигонуклеотидные зонды, праймеры.

Применение молекулярно-генетического метода – ДНК-типирования, позволило значительно расширить представление о полиморфизме ранее известных генетических локусов системы HLA-A, B, C, DR,DQ, DP. Кроме того, открыты новые гены, в частности TAP, DM, LMP и другие. Открыты гены HLA класса I - E, F, G, H, но функция их продуктов пока неясна. На декабрь 1998 г. число идентифицированных аллелей генов HLA-комплекса составило 942. А на 31 декабря 2000 года было выявлено молекулярно-генетическим ДНК-типированием 1349 аллелей и их обнаружение продолжает расти.

НОВАЯ НОМЕНКЛАТУРА HLA . Как уже отмечалось, молекулы HLA 1 класса состоят из α- и β-цепей. Причем полиморфной является только α-це .пьАллельные варианты кодирующих генов получили в новой номенклатуре четырехзначное наименование (например, HLA-A0201 вместо ранее применяемого обозначения HLA-A2 , причем методами молекулярной биологии установлено12 (!) новых субтипов этого антигена (новых аллельных вариантов), получивших наименование А0201, А0202, А0203, … до А0212). У HLA-B27 установлено 9 аллельных вариантов специфичности и только часть из них ассоциирована с анкилозирующим спондилитом(это, естественно, повышает их прогностическую ценность).

Эффективность трансплантации аллогенных почек(по результатам годовой выживаемости в центрах трансплантологии, перешедших на селекцию доноров на основе молекулярно-генетического

координационного центра органного донорства и институтом Иммунологии.

Ещё более впечатляющие данные, полученные за последние2-3 года в ходе проведения национальных (в первую очередь в США) и международных программ по пересадке аллогенного, «неродственного» костного мозга. Благодаря переходу селекции пар донор-реципиент на -ДНК типирование и созданию банкаHLA-генотипированных доноров, включающего 1,5 млн. человек, годовую выживаемость пересаженного костного мозга удалось повысить 10с -20% до 70-80% (!). В свою очередь это привело к тому, что число трансплантаций костного мозга от неродственных доноров в США (где в настоящее время насчитывается наибольшее число генотипированных доноров и реципиентов) за период с 1993 по 1997 г. возросло более чем в 8 раз. Ошеломляющий

эффект от пересадок неродственного костного мозга достигнут исключительно за счет подбора полностью HLA совместимых пар донор-реципиент ДНК-типированием.

Ниже приводится выдержка из книги академика Р.В.Петрова«Я или не я: Иммунологические мобили». М., 1983. - 272 с.

«…Получая в 1930 году Нобелевскую премию, в своей торжественной лекции по этому поводу Карл Ландштейнер говорил, что открытие всё новых антигенов в клетках человеческих тканей будет

теоретический интерес. Оно нашло в числе других практических применений судебно-медицинское применение.

Представьте себе такую ситуацию: необходимо определить принадлежность пятна крови. Чья эта кровь – человека или животного? Нет необходимости объяснять, что такая ситуация чаще всего имеет отношение к криминалистике. И решение задачи зачастую становится ответом на главнейшие вопросы следствия. Ответить не него можно только с помощью иммунных сывороток. Ни по каким

другим показателям различить кровь человека и, например, собаки невозможно. Микроскопические или биохимические методы исследования бессильны.

Судебные медики имеют в арсенале своих средств набор иммунных сывороток различной специфичности: против белков человека, лошади, курицы, собаки, коровы, кошки и т.д. Исследуемое пятно смывают, а затем ставят реакции преципитации. При этом используют весь набор иммунных сывороток. Какая сыворотка вызовет преципитацию, тому виду животного или человеку принадлежит кровь исследуемого пятна.

Допустим, судебный эксперт заключает: «Нож испачкан кровью человека». А подозреваемый в убийстве говорит: «Да. Но это моя кровь. Не так давно этим ножом я порезал свой палец». Тогда экспертиза продолжается. На столе криминалистов появляются антисыворотки против групп крови и к HLA-антигенам. И иммунология снова дает точный ответ: кровь относится к группе АВ, содержит фактор М, резус-отрицательный, антигены гистосовместимости такие то и т.д. Ситуация окончательно

разъясняется. Полученная характеристика полностью совпадает с антигенной характеристикой крови подозреваемого. Следовательно, он сказал правду, это действительно его кровь.

Остановимся ещё на одной ситуации, которая имеет огромное моральное звучание. Представьте себе, что война или иное бедствие разлучили родителей с детьми. У детей потерялись фамилии и имена. Неужели нельзя найти своего ребенка среди других? Ведь антигены эритроцитов и HLA передаются по наследству. И если у отца и матери нет фактора, Мто его не может быть и у ребенка. И наоборот, если оба родителя принадлежат к группе А, то ребенок не может иметь группу крови В или АВ. Так же и по HLA-антигенам. Причем с очень высокой достоверностью».

Установление подлинности останков членов царской семьи НиколаяII проводилось именно так, с помощью ДНК типирования.

например, в Англии, к вопросам определения отцовства относятся особенно щепетильно. Но там это чаще всего связано не с войной. Строгие законы об отцовстве объясняются строгими законами о наследниках и правах наследования капиталов, титулов, прав, привилегий.

Вообразите лорда, который объявляет своим наследником юношу, которого родила не его жена. Тогда может возникнуть необходимость доказать, что юноша его сын. Или вдруг появляется джентльмен, объявляющий себя незаконнорожденным сыном и, следовательно, наследником миллионера. Может быть, это правда, но может быть, сей джентльмен – аферист. Вопрос решает анализ антигенов родителей и детей».

Распределение HLA-антигенов оказалось разным у представителей разных рас национальностей. С 1966 г. интенсивное исследование структуры антигенов тканевой совместимости по инициативе ВОЗ стало проводиться во всех странах мира. Вскоре карта мира оказалась покрытой иммунологическими иероглифами, показывающими, где и в каком сочетании встречаются антигены

HLA. Теперь, пожалуй, нет необходимости подобно Туру Хейердалу снаряжать экспедицию на тростниковой лодке, чтобы доказать миграцию населения из Южной Америки на острова Полинезии. Достаточно взглянуть в современный атлас распространенияHLAантигенов и с уверенностью сказать, что в обоих этих географических регионах есть общие генетические маркеры.

Полиморфизм классических HLA - антигенов, выявляемых серологическими и клеточно-опосредованными методами

Главный комплекс гистосовместимости - это группа генов и кодируемых ими антигенов клеточной поверхности, которые играют важнейшую роль в распознавании чужеродного и развитии иммунного ответа. Главный комплекс гистосовместимости человека получил названиеHLA . HLA был открыт в 1952 г. при изучении антигенов лейкоцитов. Антигены HLA представляют собой гликопротеиды, находящиеся на поверхности клеток и кодируемые группой тесно сцепленных генов 6-й хромосомы. Антигены HLA играют важнейшую роль в регуляции иммунного ответа на чужеродные антигены и сами являются сильными антигенами.

Антигены HLA подразделяются на антигены класса I и антигены класса II . Антигены HLA класса I необходимы для распознавания трансформированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами.

Важнейшая функция антигенов HLA класса II - обеспечение взаимодействия между Т-лимфоцитами и макрофагами в процессе иммунного ответа. Т-хелперы распознают чужеродный антиген лишь после его переработки макрофагами, соединения с антигенами HLA класса II и появления этого комплекса на поверхности макрофага.

Способность Т-лимфоцитов распознавать чужеродные антигены только в комплексе с антигенами HLA называют ограничением по HLA . Определение антигенов HLA классов I и II имеет большое значение в клинической иммунологии и используется, например, при подборе пар донор-реципиент перед трансплантацией органов.

Открытие MHC произошло при исследовании вопросов внутривидовой пересадки тканей. Генетические локусы, ответственные за отторжение чужеродных тканей, образуют в хромосоме область, названную главным комплексом гистосовместимости (MHC) (англ. major histocompatibility complex).

Затем, первоначально в гипотетической, на основании клеточной феноменологии, а затем в экспериментально хорошо документированной форме с использованием методов молекулярной биологии было установлено, что Т-клеточный рецептор распознает не собственно чужеродныйантиген, а его комплекс с молекулами, контролируемыми генами главного комплекса гистосовместимости. При этом и молекула MHC и фрагмент антигена контактируют с ТКР.

MHC кодирует два набора высокополиморфных клеточных белков, названных молекулами MHC класса I и класса II. Молекулы класса I способны связывать пептиды из 8-9 аминокислотных остатков, молекулы класса II - несколько более длинные.

Высокий полиморфизм молекул MHC, а также способность каждой антигенпрезентирующей клетки (АПК) экспрессировать несколько разных молекул MHC обеспечивают возможность презентации T-клеткам множества самых различных антигенных пептидов.

Следует отметить, что хотя молекулы MHC и называются обычно антигенами, они проявляют антигенность только в том случае, когда распознаются иммунной системой не собственного, а генетически иного организма, например, при аллотрансплантации органов.

Наличие в МНС генов, большинство из которых кодирует иммунологически значимые полипептиды, заставляет думать, что этот комплекс эволюционно возник и развивался специально для осуществления иммунных форм защиты.

Существуют еще и молекулы MHC класса III , но молекулы MHC класса I и молекулы MHC класса II являются наиболее важными в иммунологическом смысле.

B-клеточный рецептор, или B-клеточный рецептор антигена (англ. B-cell antigen receptor, BCR ) - мембранный рецептор В-клеток, специфично узнающий антиген . Фактически В-клеточный рецептор представляет собой мембранную форму антител(иммуноглобулинов), синтезируемых данным В-лимфоцитом, и имеет ту же субстратную специфичность, что и секретируемые антитела. Этот рецептор, как и антитела, может существовать в нескольких формах в зависимости от того, к какому классу принадлежат его тяжёлые цепи. С В-клеточного рецептора начинается цепь передачи сигнала внутрь клетки, которая в зависимости от условий может приводить к активации, пролиферации, дифференцировке или апоптозу В-лимфоцитов . Сигналы, поступающие (или не поступающие) от B-клеточного рецептора и его незрелой формы (пре-В-клеточного рецептора), оказываются критическими в созревании В-лимфоцитов и в формировании репертуара антител организма.

Помимо мембранной формы антитела, в состав B-клеточного рецепторного комплекса входит вспомогательный белковыйгетеродимер Igα/Igβ (CD79a/CD79b), который строго необходим для функционирования рецептора . Передача сигнала от рецептора проходит при участии таких молекул, как Lyn, SYK, Btk, PI3K, PLCγ2 и других.

Известно, что В-клеточный рецептор играет особую роль в развитии и поддержании злокачественных В-клеточных заболеваний крови. В связи с этим большое распространение получила идея применения ингибиторов передачи сигнала от этого рецептора для лечения данных заболеваний. Несколько таких препаратов показали себя эффективными и сейчас проходят клинические испытания .

ГЕНЕТИКА ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

МНС (Major Histocompatibility Complex) - главный комплекс гистосовместимости - система генов, кодирующих антигены, определяющих функционирование иммунной системы

HLA (Human Leucocyte Antigen) - главный комплекс гистосовместимости человека

История открытия

Открытие МНС.

Нобелевская премия 1980 г.

Жан Доссе

Открыл первый антиген гистосовместимости человека (HLA)

Джордж Снелл

Открыл антигены гистосовместимости у мыши (комплекс Н-2)

Барух Бенацерраф

Открыл гены иммунного ответа (Ir-гены)

Функции МНС

• · Распознавание «свой - чужой» - реакция отторжения трансплантата, РТПХ (реакция трансплантат против хозяина)
• · Регуляция взаимодействий клеток иммунной системы - рестрикция вовлечения в иммунный ответ лимфоцитов, через презентацию АГ
• · Регуляция силы иммунного ответа на антиген - гены иммунного ответа (Ir) - от англ. immune response

ХАРАКТЕРИСТИКИ МНС

Гены комплекса MHC (в отличие от генов TCR и Ig) не подвергаются рекомбинации.

Механизм их приспособления к вариабельности (неограниченному множеству потенциальных АГ) заключается в их генетическом полиморфизме, полигенности и кодоминантном типе наследования

ПОЛИМОРФИЗМ

Существование большого количества различных специфичностей HLA-генов в пределах каждого локуса. Гены отличаются между собой по нуклеотидным последовательностям, входящим в вариабельный участок ДНК

ПОЛИГЕННОСТЬ

Наличие нескольких неаллельных близкосцепленных генов, белковые продукты которых сходны в структурном отношении и выполняют идентичные функции

ПОЛИГЕННОСТЬ и ПОЛИМОРФИЗМ

Система HLA, включает гены

1 класса: А, В, С; 2 класса: DR, DP, DG

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КАРТА МНС

Номер хромосомы человек - 6р 21.1-21.3

Гены MHC делятся на три группы.

Каждая группа включает гены, контролирующие синтез полипептидов одного из трех классов MHC

· MHC-I класс

Гены групп HLA-A, HLA-B и HLA-C кодируют молекулы MHC класса I.

· MHC-II класс

Гены групп HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR кодируют молекулы MHC класса II. гистосовместимость генетический полиморфизм вирусный

• · MHC-III обозначает область между MHC-I и MHC-II, здесь картированы гены, кодирующие некоторые компоненты системы комплемента (C4a и C4b, С2, фактора В), цитокинов - (TNF-б и лимфотоксина), 21-гидроксилазы (фермента, участвующего в биосинтезе стероидных гормонов) и др.
• · Неклассические гены не принадлежат ни к одному из классов MHC. Описано 6 таких генов в области расположения генов MHC-I (Е, F, G, Н, J, X), и 6 - в области MHC-II (DM, DO, CLIP, TAP, LMP, LNA)

НАСЛЕДОВАНИЕ МНС

Гены MHC кодоминантны, т.е. одновременно экспрессируются гены материнской и отцовской хромосом. Генов MHC-I по 3 (А, В, С) в каждой из гомологичных хромосом, генов MHC-II - также по 3 (DP, DQ, DR); следовательно, если у матери и отца нет одинаковых аллелей, то каждый человек имеет как минимум 12 различных основных аллелей каждого гена MHC классов I и II, вместе взятых.

Кодоминантность

Известно около 2000 аллельных генов.

Аллели HLA I класса - более 900

Аллели HLA II класса - более 600

Продукты генов МНС играют центральную роль в распознавании «свой-чужой» при иммунном реагировании

СТРОЕНИЕ

классических МНС

Класс I

Класс II

ЛОКУСЫ ЛОКУСЫ

А, В, С DP, DQ, DR

МНС I класса

Молекула I класса состоит из 2-х цепей. Тяжелой б-цепи и легкой в2-микроглобулина

б-цепь, включает три фрагмента: внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический.

Внеклеточный содержит 3 домена - б1, б2 и б3. Связывание антигенного пептида происходит в щели, образованной б1- и б2-доменами.

Экзонная организация генов, кодирующих б-цепь молекул I класса

• 1 экзон, кодирующий сигнальный пептид,
• 4 экзона, кодирующие 3 внешних и трансмембранный домены,
• 2 экзона, кодирующие небольшой цитоплазматический домен

Экспрессия и функции МНС 1 класса

Экспрессия антигены представлены на всех клетках, тканях и органах, поэтому они являются главными трансплантационными антигенами.

• · Реакция отторжения трансплантата;
• · Рестрикция активности цитотоксических реакций Т-киллеров.

Презентация АГ

MHC-I «обслуживают» зону цитозоля, сообщающегося через ядерные поры с содержимым ядра. Здесь происходит фолдинг синтезированных белковых молекул.

При возникновении ошибок (в том числе и при синтезе вирусных белков) белковые продукты расщепляются в мультипротеазных комплексах (протеосомы). Образующиеся пептиды связываются с молекулами MHC-I, которые представляют T-лимфоцитам внутриклеточно образующиеся пептидные АГ. Поэтому CD8+ T-лимфоциты, которые распознают комплексы АГ с MHC-I, участвуют в первую очередь в защите от вирусных, а также внутриклеточных бактериальных инфекций

Этапы подготовки вирусных белков к взаимодействию с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости

I этап - разрушение вирусных белков, находящихся в цитозоле, с помощью протеазного комплекса - протеосомы.

II этап - транспорт образовавшихся пептидов во внутреннее пространство эндоплазматического ретикулума с помощью ТАР-1 и ТАР-2, образующих гетеродимер на эндоплазматической мембране.

III этап - встреча транспортируемых пептидов с молекулами I класса МНС. Взаимодействие пептида с молекулой I класса приводит к отсоединению калнексина. Образовавшийся комплекс пептид: молекула I класса готов к дальнейшему транспорту к плазматической мембране.

IV этап - комплекс через аппарат Гольджи транспортируется к клеточной поверхности, вирусный пептид в комплексе с молекулой I класса МНС становится доступным (иммуногенным) для его распознавания TCR

МНС II класса

Молекула II класса гетеродимер из двух нековалентно связанных цепей б и в, каждая из которых включает два домена: б1, б2 и в1, в2 (соответственно). Антигенсвязывающую областьобразуют б1- и в1-домены.

Экзонная организация генов, кодирующих б и в-цепи молекул II класса

• 1 экзон кодирует лидерную последовательность.
• 2 и 3 экзоны - первые (б-1 или в-1) и вторые (б-2 или в-2) внешние домены соответственно.
• 4 экзон кодирует трансмембранный участок и часть цитоплазматического фрагмента.
• 5 и 6 экзон - цитоплазматический «хвост»

Экспрессия и функции МНС II класса

Экспрессия антигены представлены на макрофагах, В-лимфоцитах и активированных Т-лимфоцитах.

Реакция трансплантат против хозяина

Рестрикция взаимодействий:

• · Т-h1
• · Т-h2

MHC-II. Зона «обслуживания» связана с внеклеточной средой и с клеточными органоидами (аппарат Гольджи, ЭПС, лизосомы, эндосомы и фагосомы).

Пептиды, образующиеся в данной зоне, имеют внеклеточное происхождение - это продукты протеолиза белков, захваченных клеткой посредством эндоцитоза или фагоцитоза. Молекулы MHC-II с помощью кальнексина экспонируются внутрь везикул (эндосом или фаголизосом) и только здесь, связавшись с пептидным АГ, принимают необходимую конформацию для дальнейшей экспрессии на мембране клетки.

Таким образом, молекулы MHC-II осуществляют представление АГ при развитии иммунных реакций на внеклеточные инфекции. Главную роль в этих реакциях играют CD4+ T-лимфоциты, распознающие АГ в комплексе с MHC-II. Этапы подготовки вирусных белков к взаимодействию с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости.

I этап - поглощение бактерий или их токсинов фагоцитирующей, способной к презентации антигена клеткой и разрушение захваченного материала до отдельных пептидов в фаголизосомах.

II этап - во внутреннем пространстве ЭПР происходит сборка молекул II класса, которые до встречи с пептидом комплексированы со с инвариантной цепью (Ii). Этот белок защищает молекулу II класса от случайной встречи с бактериальными пептидами в эндоплазматическом ретикулуме. Комплекс молекулы II класса с Ii покидает эндоплазматический ретикулум в составе вакуоли.

III этап - вакуоль, содержащая комплекс молекулы II класса с Ii, сливается с фаголизосомой. Протеазы разрушают Ii белок и снимают запрет на взаимодействие МНС II с бактериальными пептидами. Комплекс пептид + МНС II в составе секреторной вакуоли перемещается к мембране. Результат - экспрессия АГ пептида в комплексе с МНС II класса на клеточной поверхности.

Это обеспечивает доступность АГ пептида для TCR Т-клеток.

СРАВНЕНИЕ МНС I и II класса

Строение молекул HLA класса II принципиально сходно со строением молекул I класса, несмотря на различие в составе образующих их субъединиц.

ТМ - трансмембранный домен, ЦИТ - цитоплазматический домен, ВК - внеклеточный домен

Экспрессия на клеточной мембране